Негизги айырма – NGS менен Sanger ырааттуулугу
Next Generation Sequencing (NGS) жана Sanger Sequencing - убакыттын өтүшү менен иштелип чыккан нуклеотиддердин секвенирлөө ыкмаларынын эки түрү. Sanger Sequencing методу көп жылдар бою кеңири колдонулуп келген жана NGS өзүнүн артыкчылыктарынан улам аны жакында алмаштырды. NGS менен Sanger Sequencing ортосундагы негизги айырма NGS секвенирлөө системасы аркылуу бир эле учурда миллиондогон ырааттуулуктарды тизүү принцибинде иштейт, ал эми Sanger Sequencing ДНК полимераза ферменти менен дидеоксинуклеотиддердин тандалма кошулушунан улам чынжырды токтотуу принцибинде иштейт. ДНКнын репликациясы жана капиллярдык электрофорездин натыйжасында фрагменттердин бөлүнүшү учурунда.
Нуклеотиддердин тизилиши деген эмне?
Генетикалык маалымат организмдин ДНКсынын же РНКсынын нуклеотиддик тизмегинде сакталат. Берилген фрагменттеги (гендеги, гендердин кластериндеги, хромосомадагы жана толук геномдогу) нуклеотиддердин туура тартибин (төрт негизди колдонуу менен) аныктоо процесси нуклеотиддердин тизилиши деп аталат. Геномикалык изилдөөлөр, криминалистикалык изилдөөлөр, вирусология, биологиялык систематика, медициналык диагностика, биотехнология жана башка көптөгөн тармактарда гендердин түзүлүшүн жана функциясын талдоо абдан маанилүү. Окумуштуулар тарабынан иштелип чыккан секвенирлөө ыкмаларынын ар кандай түрлөрү бар. Алардын арасында 1977-жылы Фредерик Сэнгер тарабынан иштелип чыккан Сэнгер секвенциясы кеңири колдонулган жана кийинки муундун ырааттуулугу аны алмаштырганга чейин көп убакыт бою популярдуу болгон.
NGS деген эмне?
Кийинки муундун ырааттуулугу (NGS) - заманбап жогорку өткөрүү жөндөмдүүлүгүн секвенирлөө процесстерине карата колдонулган термин. Ал геномдук изилдөөлөрдү жана молекулярдык биологияны өзгөрткөн бир катар заманбап секвенирлөө технологияларын сүрөттөйт. Бул ыкмалар Illumina секвенциясы, Roche 454 секвенциясы, Ion Proton секвенциясы жана SOLiD (Oligo Ligation Detection аркылуу секвенирлөө) секвенциясы. NGS системалары тезирээк жана арзаныраак. NGS системаларында төрт негизги ДНК секвенирлөө ыкмалары колдонулат, атап айтканда; пиросеквенирлөө, синтез жолу менен секвенирлөө, лигация жана ион жарым өткөргүч секвенирлөө. Көп сандаган ДНК же РНК тилкелери (миллиондогон) параллелдүү тизилиши мүмкүн. Көбүрөөк убакытты талап кылган Сэнгер секвенирлөөсүнөн айырмаланып, ал кыска убакыттын ичинде организмдердин бүт геномунун секвенирлөөсүнө мүмкүндүк берет.
NGS кадимки секвенирлөө Сэнгер ыкмасына караганда көптөгөн артыкчылыктарга ээ. Бул кичинекей үлгү өлчөмү менен аткарылышы мүмкүн болгон жогорку ылдамдыктагы, так жана үнөмдүү процесс. NGS метагеномикалык изилдөөлөрдө, жеке геномдун ичиндеги киргизүү жана жок кылуудан улам вариацияларды аныктоодо жана ген экспрессияларын талдоодо колдонулушу мүмкүн.
1-сүрөт: NGS ырааттуулугундагы өнүгүүлөр
Sanger Sequencing деген эмне?
Sanger Sequencing 1977-жылы Фредерик Сэнгер жана анын кесиптештери тарабынан берилген ДНК фрагментинин нуклеотиддердин так тартибин аныктоо үчүн иштелип чыккан секвенирлөө ыкмасы. Ал ошондой эле чынжыр токтотуу секвенциясы же Dideoxy секвенциясы катары белгилүү. Бул методдун иштөө принциби ДНКнын репликациясында ДНК полимеразасы менен ddGTP, ddCTP, ddATP жана ddTTP сыяктуу дидеоксинуклеотиддерди (ddNTPs) бүтүргөн чынжырдын тандалма кошулушу менен жипче синтезин токтотуу болуп саналат. Кадимки нуклеотиддерде катар түзүүнү улантуу үчүн чектеш нуклеотиддердин ортосунда фосфодиэфир байланышын түзүү үчүн 3' OH топтору бар. Бирок, ddNTPs бул 3' OH тобу жок жана нуклеотиддердин ортосунда фосфодиэфир байланыштарын түзө алышпайт. Демек, чынжырдын узартылышы токтойт.
Бул ыкмада секвенирлене турган бир тилкелүү ДНК in vitro ДНК синтези үчүн шаблон тизмеги катары кызмат кылат. Башка талаптар олигонуклеотиддик праймер, дезоксинуклеотид прекурсорлору жана ДНК полимераза ферменти болуп саналат. Максаттуу фрагменттин каптал учтары белгилүү болгондо, праймерлерди ДНКнын репликациясы үчүн оңой эле иштеп чыгууга болот. Төрт өзүнчө ДНК синтези реакциясы төрт өзүнчө түтүктө жүргүзүлөт. Ар бир түтүк башка талаптар менен бирге өзүнчө ddNTPs бар. Өзгөчө нуклеотидден dNTPs жана ddNTPs аралашмасы кошулат. Ошо сыяктуу эле, төрт аралашмасы менен төрт түтүкчө төрт өзүнчө реакциялар жүргүзүлөт. Реакциялардан кийин ДНК фрагменттерин аныктоо жана фрагменттин үлгүсүн ырааттуулук маалыматына айландыруу жүргүзүлөт. Алынган ДНК фрагменттери жылуулук менен денатурацияланат жана гел электрофорези менен бөлүнөт. Эгерде радиоактивдүү нуклеотиддер колдонулса, полиакриламиддик гелдеги тилкелүү схеманы авторрадиография аркылуу көрүүгө болот. Бул ыкма флуоресценттик тег менен тагылган дидеоксинуклеотиддерди колдонгондо, ал гелдин деңгээлине чейин азайтылышы мүмкүн жана флуоресценттик детектор тарабынан аныктала турган лазер нурунан өтүшү мүмкүн. Тизмени көз менен окуп, компьютерге кол менен киргизүүдө пайда болушу мүмкүн болгон каталарды болтурбоо үчүн, бул ыкма компьютер менен бирге автоматташтырылган секвенжерди колдонууга иштелип чыккан.
Бул Адам геному долбоорундагы ДНКны тизмектөө үчүн колдонулган ыкма. Бул ыкма дагы эле өркүндөтүлгөн өзгөртүүлөр менен колдонулууда, анткени ал кымбат жана жай процесс болгонуна карабастан, так ырааттуулук маалыматын берет.
2-сүрөт: Сангер ырааттуулугу
NGS менен Sanger Sequencing ортосунда кандай айырма бар?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Кийинки муундун ырааттуулугу (NGS) заманбап жогорку өткөрүү жөндөмдүүлүгүн секвенирлөө процесстерине тиешелүү. Ал бир катар заманбап секвенирлөө технологияларын сүрөттөйт | Sanger Sequencing – бул ДНК фрагментинин так нуклеотиддер тартибин аныктоо үчүн Фредерик Сэнгер тарабынан иштелип чыккан секвенирлөө ыкмасы. |
| Чыгымдардын натыйжалуулугу | |
| NGS арзаныраак процесс, анткени ал убакытты, адам күчүн жана химиялык заттарды азайтат. | Бул кымбат процесс, анткени ал убакытты, адам күчүн жана көбүрөөк химиялык заттарды талап кылат. |
| Ылдамдык | |
| Бул тезирээк, анткени химиялык аныктоо жана көптөгөн жиптердин сигналын аныктоо параллелдүү болуп жатат. | Бул көп убакытты талап кылат, анткени химиялык аныктоо жана сигналды аныктоо эки башка процесс катары ишке ашат жана бир эле учурда жипте гана окуй алат. |
| Ишенимдүүлүк | |
| NGS ишенимдүү. | Sanger тизмегинин ишенимдүүлүгү азыраак |
| Үлгү өлчөмү | |
| NGS азыраак өлчөмдө ДНК талап кылат. | Бул ыкмага көп сандагы калыптуу ДНК керек. |
| Ар бир ырааттуу фрагментке ДНК негиздери | |
| Бир ырааттуу фрагменттеги ДНК негиздеринин саны Сэнгер ыкмасынан азыраак | Түзүү ырааттуулугу NGS ырааттуулугунан узунураак. |
Кыскача маалымат – NGS жана Сангер ырааттуулугу
NGS жана Sanger Sequencing - Молекулярдык биологияда кеңири колдонулган нуклеотиддердин секвенирлөө ыкмалары. Sanger секвенциясы NGS менен алмаштырылган эрте секвенирлөө ыкмасы болуп саналат. NGS менен Sanger Sequencing ортосундагы негизги айырмачылык NGS жогорку ылдамдыкта, так жана үнөмдүү процесс болуп саналат. Эки ыкма тең Генетика жана Биотехнологияда ири эпидемияларды жаратты.
