Негизги айырмачылык – Максам Гилберт менен Сэнгер секвенциясы
Нуклеотиддер ДНКнын негизги структуралык бирдиктери жана курулуш материалы болуп саналат. ДНК молекуласы полинуклеотиддик чынжырдан турат. ДНКда төрт түрдүү нуклеотид бар. Бул нуклеотиддер А (аденин), G (гуанин), С (цитозин), Т (тимин) деп аталган төрт түрдүү азоттук негиздерден турат. ДНК молекуласындагы нуклеотиддердин тизилиши организмдердин өсүшү жана өнүгүүсү үчүн маанилүү бир генетикалык маалыматты коддоосу үчүн чоң мааниге ээ. ДНК секвенциясы ДНКнын так нуклеотиддик ырааттуулугун аныктаган процессти билдирет. ДНК тизмегинин ар кандай ыкмалары бар. Максам Гилберт секвенирлөө жана Сэнгер ДНК секвенирлөө биринчи муун секвенирлөө таандык ДНК секвенирлөөнүн эки ыкмасы болуп саналат. Максам Гилберттин секвенирлөө процедурасы төрт нуклеотиддин ар биринде жана гел электрофорезинде артыкчылыктуу түрдө 5' аягы менен белгиленген ДНК фрагменттерин химиялык жол менен ажыратып, базалык ырааттуулукту аныктайт. Сэнгер секвенирлөө процедурасы ДНК полимераза жана дидеоксинуклеотиддерди жана гел электрофорезин колдонуу менен бир саптуу ДНКны синтездөө жолу менен нуклеотиддердин ырааттуулугун аныктайт. Бул Максам Гилберт менен Сэнгер тизмегинин ортосундагы негизги айырма.
Максам Гилберт секвенциясы деген эмне?
Максам Гилберт секвенциясы, ошондой эле химиялык секвенирлөө ыкмасы катары белгилүү, ДНКдагы нуклеотиддердин тартибин аныктоо үчүн иштелип чыккан ыкма. Бул ыкма 1976-жылы Уолтер Гилберт жана Алан Максам тарабынан киргизилген жана аны тазаланган ДНК менен түздөн-түз аткарууга болот, анткени популярдуу болуп калды. Максам Гилберт ыкмасы ДНК секвенирлөөнүн биринчи муунуна таандык жана ал окумуштуулар тарабынан кеңири колдонулган биринчи секвенирлөө ыкмасы болгон.
Бул методдун негизги принциби 01-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, белгилүү бир негиздердеги акыркы маркаланган ДНК фрагменттерин базага тиешелүү химиялык заттар жана шарттар менен чектөө жана энбелгиленген фрагменттерди электрофорез аркылуу бөлүү менен 01-сүрөттө көрсөтүлгөн. гель боюнча алардын өлчөмдөрүнө. Фрагменттерге белги коюлгандыктан, ДНК молекуласынын ырааттуулугун оңой эле чыгарууга болот.
Максам Гилберт ыкмасы белгилүү бир негиздердеги ДНКны бузуу үчүн базанын атайын химиялык заттарды колдонот. Диметилсульфат жана гидразин химиялык заттары деп аталган эки кеңири таралган химиялык зат, тиешелүүлүгүнө жараша, пуриндерге жана пиримидиндерге тандалып чабуул жасоо үчүн колдонулат.
Максам Гилберт секвенирлөө ыкмасы төмөнкүдөй бир нече кадамдар аркылуу ишке ашырылат.
- Регистрациялык эндонуклеазаларды колдонуу менен ДНК ырааттуулугун тазалоо
- Радиактивдүү фосфаттарды кошуу менен ДНК фрагменттеринин учтарын белгилөө
- Гель электрофорези аркылуу этикеткаланган фрагменттерди этикеткаланбаган фрагменттерден тазалоо
- Акырында энбелгиленген ДНКны төрт түтүккө бөлүү жана негизги химиялык заттар менен өзүнчө иштетүү
- Ар бир түтүктүн ичиндегилерди гель боюнча өзүнчө сызыктар боюнча электрофорез жана фрагменттерди узундугуна жараша бөлүү.
- Фрагменттерди авторадиограф аркылуу аныктоо.
01-сүрөт: Максам Гилберт ырааттуулугу
Sanger Sequencing деген эмне?
Sanger Sequencing – 1977-жылы Фредерик Сэнгер жана анын кесиптештери тарабынан берилген ДНК фрагментинин базалык ырааттуулугун аныктоо үчүн иштелип чыккан секвенирлөө ыкмасы. Ал ошондой эле чынжыр токтотуу секвенирлөө же Dideoxy секвенирлөө ыкмасы катары белгилүү. Бул ыкма ddGTP, ddCTP, ddATP жана ddTTP сыяктуу чынжырды токтотуучу дидеоксинуклеотиддерди (ddNTPs) тандап киргизүү принцибинде иштейт, бир катарлуу ДНКнын синтези учурунда тизмек түзүлүшүн токтотуу үчүн. Дидеоксинуклеотиддер чектеш нуклеотид менен фосфодиэфир байланыштарын түзүү үчүн 3' OH топтору жок. Демек, ddNTP секвенирлөө учурунда жаңы пайда болгон жипке кошулгандан кийин жиптин түзүлүшү токтойт.
Бул ыкмада төрт өзүнчө ДНК синтези реакциясы (ПЦР) ddNTP бир түрү бар төрт өзүнчө түтүктө жүргүзүлөт. ПТР үчүн түтүкчөлөргө дагы башка талаптар берилет, анын ичинде праймерлер, dNTPs, Taq полимеразасы, өзгөчө шарттар ж.б. ПТР реакцияларынан кийин пайда болгон ДНК фрагменттери жылуулук менен денатурацияланат жана гел электрофорези менен бөлүнөт. Андан кийин фрагменттер 02-сүрөттө көрсөтүлгөндөй белгиленген (радиоактивдүү же флуоресценттүү) праймерди же dNTPтерди колдонуу менен визуализацияланат.
02-сүрөт: Сангер ырааттуулугу
Максам Гилберт менен Сэнгер секвенсациясынын ортосунда кандай айырма бар?
Максам Гилберт менен Сэнгер секвенциясы |
|
| Максам Гилберт секвенциясы ДНК секвенциясы үчүн иштелип чыккан биринчи техника. | Сэнжер секвенирлөө ыкмасы Максам Гилберт секвенирлөө ыкмасынан кийин киргизилген. |
| Колдонуу | |
| Бул ыкма сейрек колдонулат. | Санжер секвенциясы ырааттуулук үчүн адатта колдонулат. |
| Кооптуу химиялык заттарды колдонуу | |
| Ал кооптуу химиялык заттарды колдонот. | Коркунучтуу химиялык заттарды колдонуу Максам Гилберт ыкмасына салыштырмалуу чектелген. |
| Аныктоо үчүн энбелгилер | |
| Бул ыкма ДНК фрагменттеринин учтарын белгилөө үчүн радиоактивдүү P32 колдонот. | Сэнжер секвенциясы радиоактивдүү же флуоресценттик белгиленген ddNTPдерди колдонот. |
Кыскача – Максам Гилберт менен Сэнгер секвенциясы
Максам Гилберт жана Сэнгер секвенциясы - биринчи муундагы ДНК секвенирлөөсүнө ылайык келген ДНК секвенирлөө ыкмаларынын эки түрү. Максам Гилберт секвенциясы 1976-жылы ДНК секвенирлөө үчүн киргизилген биринчи ыкма болуп саналат жана ал базага тиешелүү химиялык заттар менен аягы белгиленген ДНК фрагменттерин бузуу аркылуу ишке ашырылат. Демек, ал химиялык тизмек катары белгилүү. Сэнгер секвенирлөө ыкмасы 1977-жылы киргизилген жана ddNTP менен шартталган чынжырды токтотуу реакцияларына негизделген. Сэнгер секвенирлөө ыкмасы Максам Гилберт ыкмасына караганда белгилүү болгон, анткени Максим Гилберт ыкмасынын бир нече кемчиликтери, мисалы, ашыкча убакыт керектөө, коркунучтуу химиялык заттарды колдонуу ж.б. Бул Максам Гилберт менен Сэнгер тизмегинин ортосундагы айырма.
