Негизги айырмасы – Сангер секвенциясы менен Пиросеквенсация
ДНК секвенциясы ДНК анализи үчүн абдан маанилүү, анткени белгилүү бир ДНК аймагындагы нуклеотиддердин туура түзүлүшүн билүү ал жөнүндө көптөгөн маанилүү маалыматтарды ачып берет. ДНК тизмегинин ар кандай ыкмалары бар. Сэнгер секвенирлөө жана Пиросеквенсация Молекулярдык биологияда кеңири колдонулган эки башка ДНК секвенирлөө ыкмасы. Сэнгер секвенирлөө менен Пиросеквенсациянын ортосундагы негизги айырма, Сэнгер секвенциясы нуклеотиддердин ырааттуулугун окуу үчүн ДНКнын синтезин токтотуу үчүн дидеоксинуклеотиддерди колдонот, ал эми пиросквенирлөө нуклеотиддерди кошуу жана комплементарлык ырааттуулуктун тартибин окуу үчүн синтездөө аркылуу пирофосфаттын чыгарылышын аныктайт.
Sanger Sequencing деген эмне?
Сэнжер секвенциясы 1977-жылы Фредерик Сэнгер жана анын колледждери тарабынан иштелип чыккан биринчи муундагы ДНК секвенирлөө ыкмасы. Ал чынжырды токтотуу же Дидеокси секвенциясы катары да белгилүү, анткени ал дидеоксинуклеотиддер (ddNTPs) менен чынжырды токтотууга негизделген. Бул ыкма 30 жылдан ашык убакыт бою кеңири колдонулуп келген. Сэнгердин секвенирлөө ыкмасы нуклеотиддердин туура тартибин табууга же белгилүү бир ДНК фрагментин бириктирүүгө мүмкүндүк берди. Бул in vitro ДНК репликациясы учурунда ddNTPтердин тандалма кошулушуна жана ДНК синтезин токтотууга негизделген. Кошуна нуклеотиддердин ортосунда фосфодиэстер байланышын түзүүнү улантуу үчүн 3' OH топторунун жоктугу ddNTPтердин уникалдуу өзгөчөлүгү болуп саналат. Демек, ddNTP тиркелгенден кийин, чынжырдын узартылышы токтойт жана ошол чекиттен бүтөт. Төрт ddNTP бар - ddATP, ddCTP, ddGTP жана ddTTP - Sanger секвенирлөөсүндө колдонулат. Бул нуклеотиддер ДНКнын репликация процессин токтотуп, алар ДНКнын өсүп жаткан тилкесине кошулуп, кыска ДНКнын ар кандай узундугуна алып келет. Капиллярдык гел электрофорези бул кыска ДНК тилкелерин 01-сүрөттө көрсөтүлгөндөй гелде алардын өлчөмү боюнча уюштуруу үчүн колдонулат.
1-сүрөт: синтезделген кыска ДНКнын капиллярдык гел электрофорези
ДНКнын in vitro репликациясы үчүн бир нече талаптар коюлушу керек. Алар ДНК-полимераза ферменти, шаблон ДНК, олигонуклеотиддик праймерлер жана дезоксинуклеотиддер (dNTPs). Сэнгер секвенирлөөсүндө ДНКнын репликациясы төрт өзүнчө пробиркада жана төрт типтеги ddNTPs менен өзүнчө жүргүзүлөт. Дезоксинуклеотиддер тиешелүү ddNTPs менен толук алмаштырылбайт. Өзгөчө dNTP аралашмасы (мисалы; dATP + ddATP) түтүккө киргизилет жана репликацияланат. Төрт өзүнчө түтүк продуктулары төрт өзүнчө скважинадагы гелде иштетилет. Андан кийин гелди окуу менен ырааттуулук 02-сүрөттө көрсөтүлгөндөй түзүлүшү мүмкүн.
02-сүрөт: Сангер секвенциясы
Сэнжер секвенциясы молекулярдык биологиянын көптөгөн тармактарында жардам берген маанилүү ыкма. Адам геному долбоору Сэнгер секвенирлөөнүн негизиндеги методдорунун жардамы менен ийгиликтүү аяктады. Сэнгер секвенциясы максаттуу ДНК секвенирлөөдө, рак жана генетикалык ооруларды изилдөөдө, ген экспрессиясын талдоодо, адамды идентификациялоодо, патогенди аныктоодо, микробдук секвенирлөөдө ж.б. пайдалуу.
Senger секвенирлөөнүн бир нече кемчиликтери бар:
- Тизилген ДНКнын узундугу 1000 негизги жуптан узун болбошу керек
- Бир убакта бир катар тизилиши мүмкүн.
- Процесс көп убакытты талап кылат жана кымбат.
Ошондуктан, бул көйгөйлөрдү чечүү үчүн убакыттын өтүшү менен жаңы өнүккөн секвенирлөө ыкмалары иштелип чыкты. Бирок, Сангер секвенциясы дагы эле колдонулуп жатат, анткени анын 850 негизги жуп узундуктагы фрагменттерге чейинки так натыйжалары.
Пиросеквенирлөө деген эмне?
Pyrosequencing – бул “синтез аркылуу секвенирлөө” негизинде ДНКнын секвенирлөөнүн жаңы ыкмасы. Бул ыкма нуклеотиддердин кошулушунда пирофосфаттын бөлүнүп чыгышын аныктоого таянат. Бул процесс төрт түрдүү фермент тарабынан колдонулат: ДНК полимерза, АТФ сульфурилаза, люцифераза жана апираз жана эки субстрат аденозин 5' фосфосульфат (APS) жана люциферин.
Процесс бир катарлуу ДНК шаблону менен праймердин байланышынан башталат жана ДНК полимераза аны толуктоочу нуклеотиддердин кошулушун баштайт. Нуклеотиддер бириккенде (нуклеин кислотасынын полимеризациясы) пирофосфат (бири-бирине байланышкан эки фосфат тобу) топторун жана энергияны бөлүп чыгарат. Ар бир нуклеотиддин кошулушу пирофосфаттын эквимолярдык санын бөлүп чыгарат. Пирофосфат АПС субстраттын катышуусунда АТФ сульфурилаза менен АТФке айланат. Түзүлгөн АТФ люциферазанын ортомчулугу менен люцифериндин оксилуциферинге айланышына түрткү берип, АТФтин санына пропорционалдуу көлөмдө көрүнгөн жарыкты пайда кылат. Жарык фотонду аныктоочу аппарат же фотомультипликатор аркылуу аныкталып, пирограмманы түзөт. Апираза реакция аралашмасындагы АТФ жана кошулбаган dNTPдерди деградациялайт. dNTP кошуу бир жолу жүзөгө ашырылат. Нуклеотиддин кошулушу жарыктын кошулушуна жана аны аныктоосуна жараша белгилүү болгондуктан, калыптын ырааттуулугун аныктоого болот. Пирограмма 03-сүрөттө көрсөтүлгөндөй ДНК үлгүсүнүн нуклеотиддик ырааттуулугун түзүү үчүн колдонулат.
Пиросеквенирлөө бир нуклеотиддик полиморфизмди талдоодо жана ДНКнын кыска узундугун секвенирлөөдө абдан маанилүү. Жогорку тактык, ийкемдүүлүк, автоматташтыруунун жеңилдиги жана параллелдүү иштетүү пиросеквенирлөөнүн Сэнгер секвенирлөө ыкмаларына караганда артыкчылыктары болуп саналат.
03-сүрөт: Пиросеквенирлөө
Sanger Sequencing жана Pyrosequencing ортосунда кандай айырма бар?
Сэнжер ырааттуулугу менен Пиросеквенирлөө |
|
| Сэнжер секвенциясы – бул ДНК полимеразасы менен ddNTPтердин тандалма кошулушуна жана чынжырдын үзүлүшүнө негизделген ДНК секвенирлөө ыкмасы. | Пиросеквенирлөө – нуклеотиддердин кошулушунда пирофосфаттын бөлүнүп чыгышын аныктоого негизделген ДНК секвенирлөө ыкмасы. |
| ddNTP колдонуу | |
| ddNTPs ДНКнын репликациясын токтотуу үчүн колдонулат | ddNTPs колдонулбайт. |
| Катышкан ферменттер | |
| ДНК полимераза колдонулат. | Төрт фермент колдонулат: ДНК полимераза, ATP сульфурилаза, Люцифераза жана Апираза. |
| Колдонулган субстраттар | |
| APS жана Luciferin колдонулбайт. | Аденозин 5' фосфосульфат (АПС) жана люциферин колдонулат. |
| Максималдуу температура | |
| Бул жай процесс. | Бул тез процесс. |
Корытынды – Сангер секвенсировкасы жана пиросеквенциясы
Сэнгер секвенирлөө жана Пиросеквенирлөө молекулалык биологияда колдонулган эки ДНК секвенирлөө ыкмасы. Сэнгер секвенциясы чынжырдын узартылышын токтотуу менен нуклеотиддердин тартибин ырааттуулукта түзөт, ал эми пиросеквенирлөө нуклеотиддердин кошулушу жана пирофосфаттардын бөлүнүп чыгышын аныктоо аркылуу нуклеотиддердин так тартибин түзөт. Демек, Сэнгер секвенирлөө менен Пиросеквенирлөөнүн ортосундагы негизги айырма, Сэнгер секвенциясы чынжырды токтотуу менен секвенирлөө боюнча иштейт, ал эми пиросеквенирлөө синтез аркылуу секвенирлөө боюнча иштейт.
