Негизги айырма – Ген клондоо жана ПТР
Белгилүү бир ДНК фрагментинен ДНКнын көптөгөн копияларынын синтези ДНКны күчөтүү деп аталат. ДНКны күчөтүү эки негизги процесси бар, атап айтканда ген клондоштуруу жана ПЦР. Гендик клондоштуруу менен ПТРдин ортосундагы негизги айырма, ген клондоо рекомбинантты ДНКны түзүү жана кабыл алуучу бактериянын ичинде өсүү жолу менен белгилүү бир гендин бир нече көчүрмөсүн in vivo өндүрөт, ал эми ПТР бир нече жолу циклден өтүп, белгилүү бир ДНК фрагментинин in vitro миллиондогон көчүрмөсүн чыгарат. денатурация жана синтез.
Генди клондоо деген эмне?
Генди клондоо рекомбинантты ДНКны куруу аркылуу организмдин алынган геномдук ДНКсынан белгилүү бир генди табуу жана көбөйтүү үчүн колдонулган ыкма. Геномдук ДНК белоктор үчүн коддолгон миңдеген түрдүү гендерди камтыйт. ДНК алынганда, ал көтөрө ала турган бардык гендерди камтыйт. Гендерди клондоо ыкмасы жалпы ДНКдан белгилүү бир генди аныктоого мүмкүндүк берди. Ошондуктан гендерди клондоо молекулярдык биологияда маанилүү курал катары кызмат кылат.
Организмдин геномдук китепканасын түзүү, эгерде ДНКда тиешелүү гендин жайгашканы жөнүндө эч кандай маалымат жок болсо, генди клондоштурууда абдан маанилүү. Геномдук китепкана төмөнкү кадамдар аркылуу түзүлөт.
1-кадам: Керектүү генди камтыган организмден жалпы ДНКны бөлүп алуу.
2-кадам: Чыгарылган ДНКны сиңирүүнү чектөө, башкарылуучу майда фрагменттерди чыгаруу. Бул кадамга чектөө эндонуклеазалары көмөктөшөт.
3-кадам: Ылайыктуу векторду тандоо жана ошол эле чектөө эндонуклеазаларын колдонуу менен вектордук ДНКны ачуу. Бактериялык плазмидалар көбүнчө чет элдик ДНКны алып жүрүүчү векторлор катары колдонулат. Плазмидалар - бактериялардын ичинде жайгашкан ДНКнын кичинекей чөйрөлөрү.
4-кадам: Рекомбинантты ДНК молекуласын өндүрүү үчүн вектордук ДНК менен фрагменттелген ДНКны айкалыштыруу. Бул кадам ДНК лигазасы тарабынан башкарылат.
5-кадам: Рекомбинантты ДНК молекулаларын кабыл алуучу бактерияга өткөрүү. Бул кадам трансформация деп аталат жана жылуулук шок аркылуу жасалат.
5-кадам: Маданият чөйрөсүндө трансформацияланган бактериялык клеткалардын скрининги. Трансформация процессинин аягында трансформацияланган жана трансформацияланбаган кабыл алуучу клеткалардын аралаш популяциясы алынат. Кызыккан ген трансформацияланган кабыл алуучу клеткаларды гана камтыйт. Демек, трансформацияланган клеткаларды тандоо керек. Тандоо антибиотиктерди камтыган тандалма каражаттар менен жүргүзүлөт. Бул скринингдик чөйрөдө трансформацияланган клеткалар гана өсүп, тандоого мүмкүнчүлүк берет.
6-кадам: Ген китепканасын түзүү үчүн бактерияларды өстүрүү. Бул кадамда, трансформацияланган кабыл алуучу клеткалар оптималдуу өсүү талаптарын камсыз кылган жаңы маданият чөйрөсүнө киргизилет. Маданият плиталарындагы жалпы колониялар ошол организмдин геномдук китепканасын билдирет.
7-кадам: Кызыккан генди камтыган рекомбинантты ДНК молекуласы рекомбинантты ДНКнын миӊдеген клондолгон фрагменттеринен текшерилиши керек. Аны конкреттүү генди же ошол гендин белгилүү бир белоктун натыйжаларын белгилеген зонддорду колдонуу менен ишке ашырууга болот.
Бактериялык колонияны камтыган кызыкдар ген жалпы колониялардан аныкталгандан кийин, генди камтыган рекомбинантты плазмиданын миллиондогон көчүрмөлөрүн жасоого болот.
Генди клондоо ген китепканаларын түзүүдө, атайын протеиндерди, витаминдерди, антибиотиктерди, гормондорду өндүрүүдө, организмдердин геномдорун секвенирлөөдө жана картага түшүрүүдө, жеке адамдардын ДНКсынын криминалистикада бир нече көчүрмөсүн жасоодо колдонулат.
1-сүрөт: Гендерди клондоо
ПЦР деген эмне?
Полимераздык чынжыр реакциясы (ПТР) – бул белгилүү бир ДНК фрагментинин көп сандагы көчүрмөлөрүн түзүүчү ыкма. Белгилүү бир ДНК ырааттуулугунун экспоненциалдык күчөтүлүшү in vitro шартында ПТР аркылуу алынат. Бул ыкма молекулярдык биологияда абдан күчтүү курал болуп саналат, анткени ал ДНКнын кичинекей үлгүсүн колдонууга жарамдуу өлчөмдө көбөйтө алат. ПТР 1983-жылы Кари Муллис тарабынан киргизилген жана бул сыйлыкка ээ болгон ойлоп табуу молекулярдык биологияда чоң жетишкендикти жараткан.
ПТР техникасы 02-сүрөттө көрсөтүлгөндөй кайталанган ПТР реакцияларынан кийин жүргүзүлөт. Бир ПТР реакциясы үч түрдүү температурада болгон үч негизги кадамдан турат; ДНКда 94 0C денатурациялоо, праймерлерди 68 0Cде күйгүзүү жана 72де 0 C. Ошондуктан, ПТР аткарылганда, туура репликациялоо үчүн температуранын өзгөрүүсүн жогору сактоо керек. ПТР ПТР түтүкчөлөрүнүн ичиндеги ПЦР машинасында жүргүзүлөт. ПТР түтүктөрүндө калыптуу ДНК, Taq полимераза, праймерлер, dNTPs жана буфер камтыган туура ПТР аралашмалары жүктөлөт. Кош тизмектүү ДНК үлгүсүн бир тилкелүү ДНКга денатурациялоо 94 – 98 0C де комплементарлык негиздер ортосундагы суутек байланыштарын бузуу аркылуу ишке ашырылат. Андан кийин калыптуу ДНКнын бир саптары праймерлер үчүн ачылат. Бир жуп праймер (алдыга жана артка) берилиши керек жана алар жогорку температурага чыдамдуу болушу керек. Праймерлер максаттуу ДНК фрагментинин учтарын толуктаган бир саптуу кыска ДНК тизмектери. ПЦРде синтетикалык праймерлер колдонулат. Праймерлер ДНК үлгүсүнүн комплементарлык негиздери менен байланышып, жаңы тизмектин синтезин башташат. Бул кадам Taq полимераза деп аталган фермент тарабынан катализделет; Thermus auqaticusдан бөлүнүп алынган термостурдук ДНК полимераза ферменти. Праймерлер жана нуклеотиддер (курулуш материалы) болгондо, Taq полимераза ДНКнын шаблонуна толуктоочу ДНКнын жаңы тилкесин түзөт. ПТР программасынын аягында гел электрофорезинин жардамы менен күчөтүлгөн ДНК фрагменти байкалат. Эгерде кошумча анализ талап кылынса, ПЦР продукту гелден тазаланат.
ПТР генетикалык жана жүрүшкөн оорулардын диагностикасы жана мониторинги, кылмышкерлерди идентификациялоо (криминалистика жаатында), ДНКнын максаттуу сегментинин түзүмүн жана функциясын изилдөө, организмдердин геномдорун секвенирлөө жана картага түшүрүү үчүн абдан пайдалуу. ж.б. ПТР илимпоздор арасында медициналык жана молекулярдык биология изилдөө лабораторияларында күнүмдүк лабораториялык ыкма болуп калды, анткени ал көп түрдүү колдонууга ээ.
2-сүрөт: Полимераздык чынжыр реакциясы
Ген клондоо менен ПТРдин ортосунда кандай айырма бар?
Генди клондоо vs PCR |
|
| Генди клондоо - бул рекомбинантты ДНК аркылуу in vivo белгилүү бир гендин бир нече көчүрмөсүн жасоо жана кабыл алуучу бактерияга айландыруу процесси. | ПТР ыкмасы белгилүү бир ДНК ырааттуулугунун бир нече көчүрмөсүн ПТР реакцияларынын кайталанма циклдери аркылуу in vitro жаратат. |
| Рекомбинантты ДНКны түзүү талабы | |
| Рекомбинантты ДНК генди табуу үчүн өндүрүлөт. | Рекомбинантты ДНК өндүрүлгөн эмес. |
| Эмгекке муктаждык | |
| Бул процесс көп эмгекти талап кылат. | Интенсивдүү эмгектин кереги жок. |
| In vivo же In vitro процесс | |
| Рекомбинантты ДНКнын түзүлүшү in vitro жана ДНКнын күчөшү in vivo. | ДНКнын күчөшү толугу менен in vitro болот. |
Кыскача – Ген клондоо жана ПТР
Генди клондоо жана ПТР ДНКны күчөтүү үчүн колдонулган эки ыкма. ПТР – бул рекомбинантты ДНКны жана кабыл алуучу организмди колдонбостон, белгилүү бир ДНК фрагментинин ДНКсынын бир нече көчүрмөсүн түзгөн in vitro процесси. Гендерди клондоштуруу, биринчи кезекте, рекомбинантты ДНКны куруу аркылуу кабыл алуучу организмдин ичинде кызыкдар гендин бир нече көчүрмөсүн алып келген in vivo процесси. Бул генди клондоо менен ПТРдин ортосундагы айырма.
