Кадимки уяланган жана реалдуу убакыттагы ПТР анализдеринин негизги айырмасы – бул кадимки ПТР – бул ДНКнын спецификалык ырааттуулугун күчөтүү үчүн иштелип чыккан ыкма жана уяланган ПТР кадимки ПТРдин модификациясы болуп саналат, ал эки ырааттуу күчөтүү реакциясынан турат, ал эми реалдуу -time PCR – бул кадимки ПТРдин бир варианты, ал күчөтүлгөн продуктунун санын аныктоого жөндөмдүү.
ПТР – бул ДНКны аныктоо үчүн изилдөөдө жана медицинада кеңири колдонулган кеңири таралган илимий ыкма. ПЦР тесттери антигендерди алардын ДНКсын же РНКсын аныктоо үчүн колдонулат. Жалпысынан алганда, вирустук РНК антителолорду тапканга же оорунун белгилерин көрсөткөнгө чейин организмде болот. ПЦР тести кимдир бирөөнүн вирусу бар же жок экенин эрте аныктай алат. Учурда ПТР COVID-19 оорусун аныктоо үчүн стандарттуу тест болуп саналат. ПЦР ыкмаларынын ар кандай түрлөрү бар, мисалы, реалдуу убакыттагы ПТР, уяланган ПТР, мультиплекстик ПТР, ысык баштоо ПТР жана узак аралыктагы ПТР ж.б.
Кадимки ПТР анализдери деген эмне?
Кадимки ПТР анализи – бул молекулярдык биологиялык лабораторияларда үзгүлтүксүз аткарылуучу in vitro ДНКны күчөтүү ыкмасы. Бул ыкма белгилүү бир ДНК фрагментинин миңден миллиондогон көчүрмөсүн чыгарууга мүмкүндүк берди. Кари Муллис бул ыкманы 1980-жылы киргизген. Бул техниканын көп көчүрмөсүн жасоо үчүн шаблон деп аталган ДНК фрагменти талап кылынат. Taq полимераза ДНК полимераза ферменти катары иштейт жана шаблон ырааттуулугунун жаңы тилкелеринин синтезин катализдейт.
ПТР аралашмасындагы праймерлер фрагмент кеңейтүүлөрү үчүн баштапкы чекиттер катары иштейт. ДНКнын көчүрмөсүн жасоо үчүн зарыл болгон бардык ингредиенттер ПТР аралашмасына кирет. ПЦР реакциясы ПЦР машинасында ишке ашырылат жана ал туура ПЦР аралашмасы жана туура ПТР программасы менен азыктанышы керек. Эгерде реакция аралашмасы жана программа туура болсо, ал өтө аз сандагы ДНКдан ДНКнын белгилүү бир бөлүгүнүн керектүү сандагы копияларын чыгарат.
01-сүрөт: Кадимки ПТР анализи
ПЦР реакциясында үч негизги кадам бар: денатурация, праймерди күйдүрүү жана жипти узартуу. Бул үч кадам үч түрдүү температурада болот. ПТР буфери Taq полимераза аракети үчүн оптималдуу шарттарды сактайт. ПЦР реакциясынын бул үч баскычы ПЦР продуктунун керектүү көлөмүн өндүрүү үчүн кайталанат. Ар бир ПТР реакциясында ДНК копияларынын саны эки эсеге көбөйөт. Демек, ПЦРде экспоненциалдык күчөтүүнү байкоого болот. ПТР продуктуну гель электрофорезинин жардамы менен чечсе болот, анткени ал гелде көрүнгөн көлөмдөгү ДНКны пайда кылат жана аны секвенирлөө сыяктуу кийинки изилдөөлөр үчүн тазалоого болот.
ПТР медициналык жана биологиялык изилдөөлөрдөгү баалуу курал болуп саналат. Айрыкча соттук-медициналык изилдөөдө ПТР чоң мааниге ээ, анткени ал кылмышкерлердин кичинекей үлгүлөрүндөгү изилдөөлөр үчүн ДНКны күчөтүп, соттук ДНК профилдерин түзө алат. ПТР молекулярдык биологиянын көптөгөн тармактарында кеңири колдонулат, анын ичинде генотиптөө, гендерди клондоштуруу, мутацияларды аныктоо, ДНК секвенирлөө, ДНКнын микро массивдери жана аталыкты текшерүү.
Несттелген ПТР анализдери деген эмне?
Нестелген ПТР – ДНКнын спецификалык эмес күчөшүн азайтуучу ПТРдин бир түрү. Уюшкан ПТР анализинде эки удаалаш ПТР же эки ырааттуу күчөтүү реакциясы бар. Биринчи күчөтүү реакциясы учурунда ПТР продуктусу пайда болот. Биринчи реакциядан кийин биринчи реакциянын ПТР продуктусунда экинчи күчөтүү реакциясы жүргүзүлөт. Демек, экинчи реакция аралашмасындагы праймерлер биринчи ПТР продуктусу менен байланышып, аны күчөтөт.
02-сүрөт: ички PCR
Праймер жуптары ар бир реакцияда ар кандай болот. Примерлердин спецификалык эмес байланышы уяланган ПТРде азаят. Уюшкан ПТР анализдери сезгичтикти жана/же өзгөчөлүктү жогорулатуу үчүн пайдалуу. Бирок, уяланган ПТР кызыкдар ырааттуулук жөнүндө билимди талап кылат.
Чыныгы убакыттагы ПТР анализдери деген эмне?
Реалдуу убакыттагы ПТР же сандык ПТР (Q PCR) – ПТР продуктуларын сандык өлчөөчү ПТРдин өзгөртүлгөн версиясы. Ошондуктан, бул ыкма реалдуу убакыт ПТР машинасын колдонуу менен реалдуу убакытта күчөтүү санын аныктайт. Ал ошондой эле үлгүдөгү максаттуу ырааттуулуктун же гендин көлөмүн аныктоо үчүн ылайыктуу ыкма болуп саналат.
Реалдуу убакыттагы ПТРдин кызыктуу өзгөчөлүгү – бул күчөтүүнү да, чыныгы сандык аныктоону да бир кадамга айкалыштырат. Ошондуктан, аныктоо үчүн гел электрофорездин зарылдыгы реалдуу убакыт ПТР ыкмасы менен жок кылынышы мүмкүн. ПТР реакциялары учурунда ПТР продуктуларын белгилөө үчүн флуоресценттик боёкторду колдонуу акыры түздөн-түз сандык аныктоого алып келет. ПЦР продуктулары топтолгондо, флуоресценттик сигналдар да топтолот жана алар реалдуу убакыт машинасы менен өлчөнөт. SYBR Green жана Taqman реалдуу убакыт ПТРдин күчөтүү процессин аныктоо же көрүү үчүн эки ыкма болуп саналат. Эки ыкма тең күчөтүү процессинин жүрүшүнө көз салып, реалдуу убакыт режиминде продуктунун санын кабарлайт.
03-сүрөт: реалдуу убакыттагы ПТР
Реалдуу убакыттагы ПТР ген экспрессиясын сандык аныктоо, микроРНК жана коддолбогон РНК анализи, SNP генотиптөө, көчүрмө санынын варианттарын аныктоо, сейрек мутацияларды аныктоо, генетикалык жактан өзгөртүлгөн организмдерди аныктоо жана жугуштуу агенттерди аныктоо.
Кадимки уяланган жана реалдуу убакыттагы ПТР анализдеринин кандай окшоштуктары бар?
- Ишке салынган жана реалдуу убакыттагы ПТР анализдери кадимки ПТР анализинин модификациялары болуп саналат.
- Үч техника тең ДНК үлгүлөрүн күчөтөт.
- Алардын өнүмдөрүн ырааттуулукта же талдоодо колдонсо болот.
- Бул анализдер праймерлерди талап кылат.
Кадимки уяланган жана реалдуу убакыттагы ПТР анализдеринин ортосунда кандай айырма бар?
Салттуу ПТР – бул ДНКнын белгилүү ырааттуулугун күчөтүү үчүн иштелип чыккан ыкма. Ошол эле учурда, Nested ПТР – бул эки ырааттуу күчөтүү реакциясынан турган кадимки ПТРдин модификациясы, ал эми реалдуу убакыт режиминдеги ПТР кадимки ПТРдин күчөтүлгөн продуктунун санын аныктоого жөндөмдүү варианты болуп саналат. Ошентип, бул кадимки уяланган жана реалдуу убакыт ПТР анализдеринин ортосундагы негизги айырма. Кадимки жана реалдуу убакыттагы ПТРден айырмаланып, уяланган ПТР эки праймер топтомун колдонот. Мындан тышкары, спецификалык эмес күчөтүүнү азайтуу үчүн уяланган ПТРде эки удаалаш күчөтүү реакциясы бар. мындан тышкары, кадимки жана реалдуу убакыттагы ПТР анализдеринде эки ырааттуу күчөтүү реакциясы жок.
Төмөнкү инфографикада кадимки уяланган жана реалдуу убакыттагы ПТР анализдеринин ортосундагы айырмачылыктар жанаша салыштыруу үчүн таблица түрүндө келтирилген.
Кыскача маалымат – Кадимки жана уяланган жана реалдуу убакыттагы ПТР анализдери
Салттуу ПТР – бул ДНКнын белгилүү фрагменттерин көбөйтүү үчүн иштелип чыккан биринчи техника. Уюшкан ПТР жана реалдуу убакыттагы ПТР кадимки ПТРдин эки варианты болуп саналат. Уюшкан ПТРде эки ырааттуу күчөтүү реакциясы жана эки праймер топтомун колдонуу бар. Реалдуу убакыттагы ПТР күчөтүлгөн ПТР продуктунун санын аныктоо үчүн иштелип чыккан. Ошентип, бул кадимки уяланган жана реалдуу убакыт ПТР анализдеринин ортосундагы айырманы жалпылайт.
