Алтын дарбаза менен Гибсон Ассамблеясынын ортосундагы негизги айырмачылык, Голден Гейт клондоо үчүн белгилүү бир ырааттуулукта чектөө сайттарынын болушуна таянат, ал эми Гибсон Ассамблеясы белгилүү бир ырааттуулукта чектөө сайттарынын болушуна ишенбейт. клондоо.
Акыркы ондогон жылдар бою молекулярдык окумуштуулар бир нече ДНК фрагменттерин бир бөлүккө оңой чогултууга мүмкүндүк берген ар кандай стандартташтырылган процедураларды иштеп чыгышты. Ошондуктан, изилдөөчүлөр тарабынан илимий эксперименттерде чектөөчү энзим лигасы, шлюз клондоо, Гибсон ассамблеясы, Голден дарбаза ассамблеясы жана TOPO клондоо сыяктуу клондоо ыкмалары кеңири колдонулат. Ошондуктан, Голден Гейт жана Гибсон Ассамблеясы бир нече ДНК фрагменттерин бир бөлүккө чогултууга мүмкүндүк берген эки молекулалык клондоо ыкмасы.
Алтын Дарбаза Ассамблеясы деген эмне?
Алтын дарбаза – бул бир нече ДНК фрагменттерин бир бөлүккө чогултууну жеңилдеткен молекулярдык клондоо ыкмасы. Бул ыкма клондоо үчүн белгилүү бир ырааттуулукта чектөө сайттарынын болушуна таянат. Ал 1996-жылы пайда болгон. Бул ыкмада Type IIS чектөө энзимдери жана T4 ДНК лигазасы колдонулат. Бул ферменттер ДНКны таануу жерлеринен тышкары кесип. Алар палиндромдук эмес ашыкчаларды түзө алышат. Ошондуктан, ДНКнын бир нече фрагменттерин ашыкча тизмектердин айкалыштары аркылуу чогултууга болот.
01-сүрөт: Алтын дарбаза
Алтын дарбазаны чогултуу процедурасы
Алтын дарбаза техникасынын процедурасында үч негизги кадам бар:
- клондоо векторунда ашыкча жылчыктарды түзүү,
- ашыкчалардагы фрагменттерге тиешелүү ырааттуулуктарды колдонуу менен бир нече ДНК кыстарууларын чогултуу жана
- лигация.
Golden Gate монтажы тегерек клондоо векторлорун колдонот (бардык вектор). Мындан тышкары, бул ыкма, чектөө сайт сиңирүү жана ligation бир эле учурда жүзөгө ашыруу үчүн ligated продукт жок кылынат. Golden Gate үчүн типтүү жылуулук циклинин протоколу 37 °C жана 16 °C ортосунда термелет, анткени 37 °C чектөө ферменттери үчүн оптималдуу, ал эми 16 °C лигаздар үчүн оптималдуу.
Гибсон Ассамблеясы деген эмне?
Гибсон Ассамблеясы бир нече ДНК фрагменттерин бир бөлүккө чогултууга мүмкүндүк берген молекулярдык клондоо ыкмасы. Алтын дарбаза ыкмасынан айырмаланып, бул ыкма клондоштуруу үчүн белгилүү бир ырааттуулукта чектөө сайттарынын болушуна таянбайт. Аны Дж. Крейг Вентер институтунан Дэниел Гибсон тапкан. Бул ыкма ырааттуулук жана лигаза көз карандысыз клондоштуруу (SLIC) ыкмасынын бир түрү.
02-сүрөт: Гибсон Ассамблеясы
Гибсонду чогултуу процедурасы
Гибсон ассамблеясына жанындагы ДНК фрагменттери менен кабатталган 20-40 жуп базаны камтыган ДНК фрагменттери керек. Кайталануулар ПТР аркылуу кошулат. Андан кийин бул ДНК фрагменттери үч ферментке ээ Гибсон мазер аралашмасына кошулат. Бул процедура изотермикалык шарттарда (1 саатка 50 °C) үч түрдүү ферменттин жардамы менен ишке ашырылат: экзонуклеаза, ДНК полимераза жана ДНК лигаза. Экзонуклеаза ДНКны 5' учунан кайра чайнайт. Ошентип, ал полимераздын активдүүлүгүн токтотпойт жана реакциянын бир процессте жүрүшүнө мүмкүндүк берет. Кошуна ДНК фрагменттеринин натыйжасында пайда болгон бир тилкелүү аймактар бири-бирине дал келген ырааттуулуктан улам күйгүзүлүшү мүмкүн. ДНК полимераза нуклеотиддерди кошуу менен боштуктарды толтурат. Акырында, ДНК лигаза коваленттүү түрдө чектеш сегменттердин ДНКсына кошулат. Адатта, Гибсон Ассамблеясы сызыктуу көздөгөн векторлорду колдонот. Мындан тышкары, бул ыкма ырааттуулуктун окшоштугунун негизинде бир эле учурда 15ке чейин ДНК фрагменттерин бириктире алат.
Голден Гейт менен Гибсон Ассамблеясынын окшоштуктары
- Алтын дарбаза жана Гибсон Ассамблеясы эки молекулалык клондоо ыкмасы.
- Эки ыкма тең бир нече ДНК фрагменттерин бир бөлүккө чогулта алат.
- Бул ыкмалар көздөгөн векторлорду колдонот.
- Эки ыкма тең бир нече ДНК фрагменттерин чогултуу үчүн термикалык циклдерди колдонот.
- Алар сайтка багытталган мутагенезде колдонулат.
Алтын Гейт менен Гибсон Ассамблеясынын ортосундагы айырма
Алтын дарбаза бир нече ДНК фрагменттерин бир бөлүккө чогултууда колдонулган молекулярдык клондоштуруу ыкмасы, ал клондоштуруу үчүн белгилүү бир ырааттуулукта чектөө жерлеринин болушуна таянат, ал эми Гибсон Ассамблеясы молекулярдык клондоо ыкмасы болуп саналат. бир нече ДНК фрагменттерин клондоштуруу үчүн белгилүү бир ырааттуулукта чектөө жерлеринин бар экендигине ишенбестен бир бөлүккө чогултуу. Бул Golden Gate жана Гибсон Ассамблеясынын ортосундагы негизги айырма. Андан тышкары, Golden Gate ыкмасы тегерек көздөгөн векторду, ал эми Гибсон Ассамблеясынын методу сызыктуу көздөгөн векторду колдонот.
Төмөнкү инфографика Голден Гейт менен Гибсон Ассамблеясынын ортосундагы айырманы көрсөтөт.
Кыскача маалымат – Голден Гейт менен Гибсон Ассамблеясы
Молекулярдык клондоо – бул рекомбинантты ДНК молекулаларын чогултуу жана кабыл алуучу организмдердин ичинде алардын репликациясын багыттоо үчүн колдонулган ыкма. Алтын дарбаза жана Гибсон Ассамблеясы бир нече ДНК фрагменттерин бир бөлүккө чогултууга мүмкүндүк берген эки молекулярдык клондоо ыкмасы. "Алтын дарбаза" ыкмасы клондоо үчүн белгилүү бир ырааттуулукта чектөө сайттарынын болушуна таянат, ал эми Гибсон Ассамблеясы клондоо үчүн белгилүү бир ырааттуулукта чектөө сайттарынын болушуна ишенбейт. Ошентип, бул Голден Гейт менен Гибсон Ассамблеясынын ортосундагы негизги айырма.
