Негизги айырма – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green жана Taqman реалдуу убакыттагы ПТРдин күчөтүү процессин аныктоо же көрүү үчүн колдонулган эки ыкма. SYBR Green - бул нуклеиндик кычкылдык боёктордун аралашуусуна негизделген ыкма, ал эми Такман - гидролиздик зонага негизделген ыкма. Эки технология тең ПТР учурунда флуоресценцияны пайда кылуу үчүн иштелип чыккан, бул реалдуу убакыт режиминде ПТР машинасына реакцияны "реалдуу убакытта" көзөмөлдөөгө мүмкүндүк берет. SYBR Green ыкмасы SYBR жашыл деп аталган флуоресценттик боёкту колдонуу менен ишке ашырылат жана боёкту өндүрүлгөн кош саптуу ДНКга байлоо аркылуу күчөтүүнү аныктайт. Такман кош маркировкасы бар зонддордун жардамы менен жүргүзүлөт жана зонддун Taq полимеразасы менен деградацияланышы жана флюорофордун бөлүнүп чыгышы аркылуу күчөтүүнү аныктайт. Бул SYBR Green менен Taqman ортосундагы негизги айырма.
SYBR Green деген эмне?
SYBR Green – бул нуклеиндик кислоталарды, айрыкча молекулярдык биологиядагы кош тизмектүү ДНКны боёо үчүн колдонулган флуоресценттик боёк. SYBR Green ыкмасы реалдуу убакыт ПТР учурунда ПТР продуктуларынын санын аныктоо үчүн колдонулат. Ал ДНК менен байланышкандан кийин, пайда болгон ДНК-боёк комплекси көк нурду сиңирип, интенсивдүү жашыл жарыкты чыгарат. Бул эки жиптүү ДНК менен байланышта боёк молекуласында пайда болгон структуралык өзгөрүшүнөн улам болот. ПТР барган сайын көбүрөөк ДНКны жаратканда, көбүрөөк боёктун молекулалары ДНК менен байланышып, көбүрөөк флуоресценцияны пайда кылат. Ошондуктан, флуоресценция ПТР продуктунун топтолушу менен көбөйөт. Демек, ПЦР продуктунун көлөмүн SYBR Green флуоресценттик аныктоосу менен сандык түрдө өлчөөгө болот.
SYBR жашыл боёгу цитометрияда жана флуоресценттик микроскопияда ДНКны белгилөө үчүн да колдонулушу мүмкүн. Этидий бромиди SYBR Green менен ийгиликтүү алмаштырылды, анткени Этидий бромиди гель электрофорезинде ДНКны визуалдаштыруу учурунда зыяндуу канцерогендик боёк болуп саналат.
SYBR жашыл ыкмасынын артыкчылыктары жана кемчиликтери бар. Бул ыкма абдан сезимтал, арзан жана колдонууга оңой. Бирок, анын кандайдыр бир кош тизмектүү ДНКга туташуу жөндөмдүүлүгүнөн улам, спецификалык эмес байланыш ПТР продуктунун санынан ашыкча бааланышына алып келиши мүмкүн.
01-сүрөт: SYBR Green Technique
Такман деген эмне?
Такман реалдуу убакытта ПТР процессин көзөмөлдөө үчүн SYBR Greenге альтернативалуу ыкма. Бул ыкма Taq полимераза ферментинин 5' – 3' экзонуклеаздык активдүүлүгүнө жараша, жаңы жипти узартуу жана флюорофорду чыгаруу учурунда зонддорду начарлатат. Бул ыкмада кош белгилүү зонддор колдонулат жана ал зонддордун гидролизине негизделген. Зонддор 5' учунда флуоресценттик кабарчы молекуласы (флюорофор) жана 3' учунда өчүргүч молекуласы бар флуоресценттик белгиленген ДНК олигонуклеотиддери. Алар примердик аннелдердин карама-каршы жагындагы бир жиптүү калыпка байлоо үчүн иштелип чыккан. Так полимераза праймерге нуклеотиддерди кошот жана жаңы жипти кош белгиленген зонддорго карай узартат. Taq полимеразасы зонд менен жолуккандан кийин, Taq полимеразанын экзонуклеаздык аракети зондду активдештирет жана начарлатат. Ал жаңы жиптин синтезин аяктагандан кийин, зонд толук бузулууга дуушар болот жана флюорофорду бөлүп чыгарат. Флуорофордун чыгышы флуоресценцияны пайда кылат. Fluorescent Quencher молекуласы бөлүнүп чыккан жарыкты натыйжалуу өчүрөт жана ПТР продуктунун сандык көрсөткүчүн түзөт. Флюорофорлордун бөлүнүп чыгышы жана ПТР продуктуларынын саны пропорционалдуу. Демек, сандык эсептөө такман ыкмасы менен оңой жүргүзүлүшү мүмкүн.
02-сүрөт: Такман ыкмасы
Такман ыкмасы реалдуу убакытта ПТРде колдонулат, ген экспрессиясын сандык аныктоо, генетикалык полиморфизмдерди аныктоо, хромосомалык ДНКны жок кылууну сандык аныктоо, бактерияларды идентификациялоо, микроаррей анализин текшерүү, SNP генотиптөө ж.б.
SYBR жашыл менен Такмандын ортосунда кандай айырма бар?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green ДНКны байланыштыруучу боёктун негизинде. | Такман гибриддештирүү зонддорунан жана Taq полимеразанын 5'-3' экзонуклеаза активдүүлүгүнө көз каранды. |
| Флуоресценттик белгиленген зонддор | |
| Флуоресценттик белги коюлган зонддор талап кылынбайт. | Кош энбелгилүү зонддор талап кылынат. |
| Мультиплекстүү ген анализи | |
| Бул мультиплекс ген максаттары үчүн колдонулбайт. | Бул мультиплекс ген максаттары үчүн колдонулушу мүмкүн. |
| Баасы | |
| Бул арзаныраак. | Бул кымбатыраак. |
| Өзгөчөлүк | |
| Бул анча спецификалык эмес жана бардык кош тизмектүү ДНК менен байланышат | Зонддор өзгөчө күчөтүү продуктуларын аныктагандыктан, булар өзгөчө. |
| Натыйжалуулук | |
| Бул азыраак эффективдүү. | Бул абдан натыйжалуу. |
| Колдонмо | |
| Бул реалдуу убакыттагы ПТРде, агароз гелинин визуализациясында, ДНКны белгилөөдө ж.б. колдонулат. | Бул реалдуу убакытта ПТР, ген экспрессиясын сандык аныктоо, генетикалык полиморфизмдерди аныктоо ж.б. колдонулат. |
Кыскача маалымат – SYBR Green жана Taqman
Такман жана SYBR жашыл реалдуу убакыт ПТРде (сандык ПТР) колдонулган эки ыкма. Эки ыкма тең ПТР продуктунун сандык көрсөткүчүн натыйжалуу жүргүзүүгө мүмкүндүк берет жана флуоресценциянын эмиссиясына таянат. Такман ыкмасы топтолгон ДНКны аныктоо үчүн кош белгилүү зонддорду колдонот, ал эми SYBR Green ыкмасы флуоресценттик боёкту колдонот. Бул эки ыкманын тең молекулярдык биологияда ар кандай колдонулушу бар.
