Негизги айырма – RT PCR vs QPCR
Полимераздык чынжыр реакциясы - бул ДНКнын белгилүү бир аймагын in vitro күчөтүү үчүн колдонулган ыкма. Бул ыкманы 1983-жылы Кари Муллис ойлоп тапкандыктан, илимпоздор изилдөө максатында ДНКнын спецификалык фрагменттеринин миңден миллиондогон көчүрмөсүн жасай алышат. Учурда ал клиникалык жана илимий лабораторияларда кеңири колдонулуучу жана кеңири колдонулуучу ыкма болуп калды. RT ПТР, уяча ПТР, мультиплекс ПТР, Q ПТР, RT – QPCR ж.б. сыяктуу салттуу ПТР техникасынын вариациялары бар. RT ПТР жана Q ПТР ПТРдин эки маанилүү вариациясы болуп саналат. RT ПТР менен Q ПТРдин ортосундагы негизги айырма RT ПТР РНКдан толуктоочу ДНК (cDNA) транскрипттерин түзүү аркылуу ген экспрессиясын аныктоо үчүн колдонулат, ал эми Q ПТР флуоресценттик боёкторду колдонуу менен реалдуу убакытта ПТР продуктуларын сандык өлчөө үчүн колдонулат.
RT ПТР деген эмне?
Тескери транскрипциялуу полимераздык чынжыр реакциясы (RT ПТР) РНК экспрессиясын аныктоо үчүн колдонулган ПТРдин варианты. Бул кыртыштарда mRNA экспрессиясын аныктоо үчүн абдан маанилүү ыкма болуп саналат. RT ПТР үлгүнүн баштапкы материалы РНК болгондо колдонулат. RT ПТРде шаблон мРНК алгач комплементарлык ДНКга айландырылат. Бул кадам тескери транскриптаза ферменти тарабынан катализделет жана процесс тескери транскрипция деп аталат. Экинчиден, жаңы синтезделген cDNA үчүн салттуу ПТР күчөтүү үчүн колдонулат.
RT ПТР – РНК үлгүсүнүн салыштырмалуу аз көлөмүн талап кылган өтө сезгич техника. RT ПТР көбүнчө РНК түрлөрүн, өзгөчө адамдын иммундук жетишсиздик вирусу жана С гепатити вирусу сыяктуу РНК вирустарын диагностикалоодо жана сандык аныктоодо колдонулат.
01-сүрөт: RT PCR Technique
QPCR деген эмне?
Сандык ПТР (QPCR) – ПТР продуктуларын сандык өлчөө үчүн колдонулган ПТРдин варианты. Ал ошондой эле реалдуу убакыттагы полимераздык чынжыр реакциясы деп аталат, анткени ал реалдуу убакыттагы ПТР машинасынын жардамы менен реалдуу убакыттын күчөшүн өлчөйт. Бул үлгүдөгү максаттуу ырааттуулуктун же гендин көлөмүн аныктоо үчүн ылайыктуу ыкма. QPCRдин кызыктуу өзгөчөлүгү - бул күчөтүүнү да, чыныгы сандык аныктоону да бир кадамга айкалыштырат. Ошондуктан, аныктоодо гел электрофорездин зарылдыгы QPCR ыкмасы менен жок кылынышы мүмкүн. QPCR флуоресценттик боёкторду ПТР реакциялары учурунда ПТР өнүмдөрүн белгилөө үчүн колдонот, бул акыры түздөн-түз сандык аныктоого алып келет. ПЦР продуктулары топтолгондо, флуоресценттик сигналдар да топтолот жана аны реалдуу убакыт машинасы менен өлчөйт. QPCR RT ПТР менен айкалыштырылышы мүмкүн. Ал RT – QPCR же QRT – ПТР катары белгилүү жана клеткалардагы же ткандардагы РНК деңгээлин аныктоонун эң күчтүү, сезгич жана сандык ыкмасы катары каралат.
SYBR Green жана Taqman реалдуу убакыттагы ПТРдин күчөтүү процессин аныктоо же көрүү үчүн колдонулган эки ыкма. SYBR Green ыкмасы SYBR жашыл деп аталган флуоресценттик боёктун жардамы менен ишке ашырылат жана кош саптуу ДНКны өндүрүү үчүн боёкту байлап, күчөтүүнү аныктайт. Такман кош энбелгилүү зонддорду колдонуу менен ишке ашырылат жана 02-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, зонддун Taq полимеразасы менен деградациясы жана флюорофордун бөлүнүп чыгышы аркылуу күчөтүүнү аныктайт. Эки ыкма тең күчөтүү процессинин жүрүшүн көзөмөлдөйт жана продуктунун санын реалдуу убакытта кабарлайт..
Реалдуу убакыттагы ПТР ген экспрессиясын сандык аныктоо, микроРНК жана коддолбогон РНК анализи, SNP генотиптөө, копия санынын варианттарын аныктоо, сейрек мутацияларды аныктоо, генетикалык жактан модификацияланган организмдерди аныктоо, инфекциялык агенттерди аныктоо сыяктуу көптөгөн колдонмолорго ээ., ж.б.
02-сүрөт: Сандык ПТР техникасы
RT PCR менен QPCRдин ортосунда кандай айырма бар?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT ПТР – гендин экспрессиясын күчөтүү аркылуу аныктоо үчүн колдонулган ыкма. | QPCR – бул ДНКны күчөтүүчү жана ПТР продуктуларынын санын реалдуу убакытта аныктоочу техника. |
| Тескери транскриптаза ферментинин катышуусу | |
| Тескери транскриптаза ферменти RT ПТР үчүн колдонулат. | Тескери транскриптаза ферменти QPCR үчүн колдонулбайт. |
| Флуоресценттик белгиленген молекулаларды колдонуу | |
| Флуоресценттик белги коюлган боёктор же зонддор RT PCR үчүн колдонулбайт. | QPCR үчүн флуоресценттик белги коюлган боёктор же зонддор колдонулат. |
| ПЦР продуктунун сандык көрсөткүчү | |
| Эгер QPCR менен кошулбаса, RT ПТР ПТР продуктунун санын аныктай албайт. | QPCR ПТР продуктуну сандык өлчөө. |
| Башталгыч материал | |
| Баштапкы материал - мРНК. | Башталгыч материал - ДНК. |
| Синтези cDNA | |
| Комплементарлык ДНК RT ПТР учурунда өндүрүлөт. | Толуктоочу ДНК QPCR учурунда түзүлбөйт. |
Кыскача маалымат – RT PCR vs QPCR
RT ПТР жана QPCR салттуу ПТРдин эки версиясы. RT ПТР техникасы mRNA үлгүлөрү үчүн аткарылат жана ал тескери транскрипция жана cDNA өндүрүшү менен шартталган. QPCR флуоресценттик боёкторду же этикеткаланган зонддорду колдонуу менен реалдуу убакыт ПТР термикалык циклдеринде ПТР продуктуларынын санын аныктоо үчүн колдонулат. QPCRде ПТР продуктунун көлөмү үлгү тарабынан чыгарылган флуоресценттик сигналдар менен көрсөтүлөт. RT ПТР кеңири жайылтуу процесси катары колдонулат, ал эми QPCR адатта сандык аныктоо процесси катары колдонулат. Бул RT PCR менен QPCR ортосундагы айырма.
