Негизги айырмасы – Nick Translation жана Primer кеңейтүүсү
Ник котормосу жана праймердин узартылышы молекулярдык биологияда аткарылган эки маанилүү ыкма. Ник котормосунун жана праймердин кеңейтилишинин ортосундагы негизги айырма, ник котормо процесси башка гибриддештирүү ыкмалары үчүн белгиленген зонддорду чыгарат, ал эми праймерди кеңейтүү ыкмасы аралашмадан белгилүү бир РНК ырааттуулугун аныктайт жана мРНКнын экспрессиясы жөнүндө маалыматты ачып берет. Эки техника тең чоң мааниге ээ жана молекулярдык изилдөө лабораторияларында үзгүлтүксүз аткарылат.
Ник котормосу деген эмне?
Ник котормосу ар кандай молекулярдык биологиялык ыкмалар үчүн маркаланган зонддорду даярдоо үчүн колдонулган маанилүү ыкма, мисалы, тазалоо, in situ гибриддештирүү, флуоресценттүү жеринде гибриддештирүү ж.б. Бул ДНК маркалоонун in vitro ыкмасы. ДНК зонддору белгилүү ДНК же РНК тизмегин аныктоо үчүн колдонулат. Белгиленген зонддун жардамы менен нуклеин кислотасынын татаал аралашмасынан белгилүү фрагменттерди белгилөө же көрүү мүмкүн. Ошондуктан, маркаланган зонддор ар кандай техникалар үчүн колдонула турган ар кандай ыкмаларды колдонуу менен даярдалат. Ник которуу DNase 1 жана ДНК полимераза 1 ферменттеринин жардамы менен белгиленген зонддорду чыгарган ушундай ыкмалардын бири.
Ник котормо процесси DNase 1 ферментинин активдүүлүгү менен башталат. DNase 1 нуклеотиддердин ортосундагы фосфодиэстер байланыштарын ажыратуу менен кош тилкелүү ДНКнын фосфат омурткасына никстерди киргизет. Ник түзүлгөндөн кийин нуклеотиддин эркин 3' OH тобу пайда болот жана ага ДНК полимераз 1 ферменти таасир этет. ДНК-полимераза 1дин 5'тен 3'ге чейинки экзонуклеазалык активдүүлүгү нуклеотиддерди никтен ДНК тилкесинин 3' багытын көздөй жок кылат. Ошол эле учурда ДНК-полимераза 1 ферментинин полимераздык активдүүлүгү иштейт жана алынып салынган нуклеотиддердин ордуна нуклеотиддерди кошот. Эгерде нуклеотиддер белгиленген болсо, алмаштыруу белгиленген нуклеотиддер менен ишке ашат жана ал идентификация үчүн ДНКны белгилейт. Бул жаңы синтезделген энбелгиленген ДНКны молекулярдык биологияда ар кандай гибриддештирүү реакцияларында зонд катары колдонсо болот.
01-сүрөт: Никти которуу процесси
Праймер кеңейтүүсү деген эмне?
Праймер кеңейтүү - бул РНК аралашмасынан белгилүү РНК ырааттуулугун табуу жана мРНК транскриптинин 5' учунун табуу үчүн колдонулган ыкма. Ошондой эле РНКнын түзүлүшүн жана экспрессияны изилдөө үчүн колдонулат. Праймерди узартуу ыкмасы белгиленген праймерлер же белгиленген нуклеотиддер менен жүргүзүлөт. Эгерде этикеткаланган праймерлер колдонулса, анда cDNA синтези үчүн колдонулган нуклеотиддерди белгилөө зарылдыгын жокко чыгарат. Бул техникада бир нече кадамдар бар. Бул үлгүдөн РНКны алуу менен башталат. Андан кийин белгилүү бир РНК ырааттуулугунун кДНКсын синтездөө үчүн керектүү ингредиенттер менен бирге маркировкаланган олигонуклеотиддик праймер аралашмага кошулат. Праймер аралашмадан кошумча ырааттуулук менен күйгүзөт. Калып катары праймердин күйдүрүлгөн ырааттуулугун колдонуп, тескери транскриптаза ферменти РНК ырааттуулугунун комплементарлык ДНКсын (cDNA) синтездейт. Праймерди күйгүзүү жана тескери транскрипция үлгүдө РНКнын белгилүү ырааттуулугу болгондо гана пайда болот. Акырында, денатурациялоочу гель электрофорезин жүргүзгөндө РНК ырааттуулугунун өлчөмүн аныктоого болот. Ошондой эле mRNA ырааттуулугунун +1 негизин (транскрипцияны баштоо сайты) праймерди кеңейтүү ыкмасы менен табуу оңой. Эгерде ашыкча праймер колдонулса, үлгүдөгү мРНКнын көлөмүн бул ыкма менен сандык аныктоого болот.
02-сүрөт: Праймер кеңейтүүсү
Nick Translation менен Primer кеңейтүүсүнүн ортосунда кандай айырма бар?
Nick Translation vs Primer Extension |
|
| Ник которуу - бул ар кандай гибриддештирүү реакциялары үчүн энбелгиленген ДНК зонддорун түзгөн процесс. | Праймер кеңейтүү - бул белгилүү бир РНКны табуу же ген экспрессиясын изилдөө үчүн колдонулган ыкма. |
| Колдонулган ферменттер | |
| DNase 1 жана ДНК полимераза ферменттери колдонулат. | Тескери транскриптаза ферменти колдонулат. |
| Маанилүү | |
| Ник котормосу белгилүү ДНК ырааттуулугун белгилөөнү жеңилдетет. | Праймер кеңейтүүсү mRNA ырааттуулугунун белгилүү өлчөмүн жана үлгүдөгү сумманы аныктоого мүмкүндүк берет. |
Кыскача – Nick Translation vs Primer кеңейтүүсү
Ник котормосу - DNase 1 жана E coli ДНК полимераза 1 ферменттеринин активдүүлүгүнүн негизинде энбелгиленген зонддорду синтездөө үчүн колдонулган ыкма. Бул ар кандай гибриддештирүү ыкмаларына чейин лабораторияларда колдонулган in vitro ыкмасы. Ник котормосу учурунда ДНК-полимераза 1нин 5'-3' экзонуклеазалык активдүүлүгү никтин алдында нуклеотиддерди жок кылат жана ДНК-полимераза 1дин полимераздык активдүүлүгү алынып салынган нуклеотиддерди никтин артында белгиленген нуклеотиддер менен алмаштырат. Primer узартуу аралашмасынан белгилүү бир РНК транскрипт аныктоо жана өлчөмүн жана пайыздык РНК өлчөмүн аныктоо үчүн колдонулган ыкма болуп саналат. Бул ник котормосу менен праймер кеңейтүүсүнүн ортосундагы айырма.
