Негизги айырмасы – Түндүк менен Түштүк жана Батыш Блтинг
ДНКнын, РНКнын жана белоктордун белгилүү ырааттуулугун аныктоо молекулярдык биологиядагы изилдөөлөрдүн ар кандай түрлөрү үчүн өтө маанилүү. Гель электрофорези - бул ДНКны, РНКны жана белокторду өлчөмүнө жараша бөлүүчү ыкма. Гель профилдеринен, өзгөчө ДНК ырааттуулугу, РНК ырааттуулугу же протеин атайын ыкмалар менен аныкталат, блоттинг жана маркировкаланган зонддор менен гибриддештирүү. Түштүк, түндүк жана батыш сыяктуу үч түрдүү тазалоо ыкмалары бар. Түндүк түштүк менен батыштын ортосундагы негизги айырма, ал үлгүдөн аныктаган молекуланын түрүнө байланыштуу. Southern blotting - бул ДНК үлгүсүндөгү белгилүү бир ДНК ырааттуулугун аныктоочу ыкма. Northern blotting - бул РНК үлгүсүндөгү белгилүү бир РНК ырааттуулугун аныктоочу ыкма. Western blotting - протеин үлгүсүндөгү белгилүү бир протеинди аныктоочу ыкма.
Southern Blotting деген эмне?
Түштүк тазалоо ыкмасы 1975-жылы ДНК үлгүсүндөгү белгилүү бир ДНК ырааттуулугун аныктоо үчүн E. M. Southern тарабынан иштелип чыккан. Бул молекулярдык биологияга киргизилген биринчи тазалоо ыкмасы. Бул ДНКдан спецификалык гендерди, ДНКдан спецификалык фрагменттерди, ж.б. аныктоого мүмкүндүк берди. Түштүк блоттинг техникасында бир нече кадамдар бар. Алар төмөнкүдөй.
- ДНК үлгүдөн бөлүнүп алынат жана чектөө эндонуклеазалары менен сиңирилген.
- Сизделген үлгү агароза гели электрофорези менен бөлүнөт.
- Гельдеги ДНК фрагменттери щелочтуу эритмени колдонуу менен бир тилкеге денатурацияланат.
- Бир тилкелүү ДНК капилляр аркылуу нитроцеллюлоза чыпкасы мембранасына өткөрүлөт.
- Которулган ДНК мембранага биротоло бекитилет.
- Мембранада туруктуу ДНК белгиленген зонддор менен гибридделет.
- Байланбаган ДНК мембранадан жуу менен жуулат.
- Рентген пленкасы мембранага тартылып, авторрадиограф даярдалат.
Түштүк тазалоо молекулярдык биологиянын ар кандай аспектилери үчүн колдонулат. Ал RFLP картасын түзүүдө, криминалистикалык изилдөөдө, генди экспрессиялоодо ДНК метилациясында, генетикалык бузулууларда мутацияланган гендерди аныктоодо, ДНК манжа изин алууда жана башкаларда пайдалуу.
01-сүрөт: Southern Blotting Technique
Northern Blotting деген эмне?
Northern blotting – бул ген экспрессиясын изилдөө үчүн үлгүдөгү белгилүү бир РНК ырааттуулугун же mRNA ырааттуулугун аныктоого арналган ыкма. Бул ыкма 1979-жылы Альвайн, Кемп жана Старк тарабынан иштелип чыккан. Ал түштүк жана батыш тазалоо ыкмаларынан бир нече кадамдар менен айырмаланат. Бирок, бул ыкма гелдик электрофорез, тазалоо жана гибриддештирүү аркылуу белгилүү бир маркаланган зонддор жана аныктоо аркылуу жүзөгө ашырылат. Түндүк тазалоо техникасы төмөнкүдөй аткарылат.
- РНК үлгүдөн алынып, гел электрофорези менен бөлүнөт.
- РНК гелден тазалоочу мембранага өткөрүлүп берилет жана бекитилет.
- Мембрана cDNA же РНКдан даярдалган этикеткаланган зонд менен иштетилет (зонд үлгүдөгү белгилүү бир ырааттуулукка кошумча болуп саналат).
- Зонд белгилүү бир ырааттуулук менен туташуу үчүн мембрана менен инкубацияланат.
- Байланбаган зонддор жуулуп кетишти.
- Гибриддештирилген фрагменттер авторадиограф тарабынан аныкталат.
Northern blotting гибриддештирилген мРНКны аныктоодо жана сандык аныктоодо, РНК деградациясын изилдөөдө, РНКнын жарым ажыроо мезгилин баалоодо, РНКнын сплайсингин аныктоодо, ген экспрессиясын изилдөөдө ж.б. маанилүү курал болуп саналат.
02-сүрөт: Northern Blotting
Вестерн Блотинг деген эмне?
Western blotting - белгиленген антителолорду колдонуу менен протеин аралашмасынан белгилүү бир белокту аныктоо ыкмасы. Ошондуктан, western blot да иммуноблот деп аталат. Бул ыкма 1979-жылы Towbin жана башкалар тарабынан киргизилген жана азыр белок анализи үчүн лабораторияларда үзгүлтүксүз аткарылат. Кадамдар төмөнкүдөй.
- Белоктар үлгүдөн алынат
- Полиакриламиддик гел электрофорезинин жардамы менен протеиндер өлчөмү боюнча бөлүнөт
- Бөлүнгөн молекулалар электропорация жолу менен PVDF мембранасына же нитроцеллюлоза мембранасына өткөрүлөт
- Мембрана антителолор менен спецификалык эмес байланыш үчүн бөгөттөлгөн
- Трансферттелген белоктор негизги антитело (фермент менен белгиленген антитело) менен байланышкан.
- Мембрананы спецификалык эмес байланышкан негизги антителолорду жок кылуу үчүн жуушат
- Байланышкан антителолор субстрат кошуу жана пайда болгон түстүү чөктүрүүнү аныктоо аркылуу аныкталат
Western blotting адамдын кан сары суусунун үлгүсүндө ВИЧке каршы антителолорду аныктоодо пайдалуу. Вестерн блотту гепатит В инфекциясын ырастоочу тест жана жинди уйдун ылаңын аныктоочу тест катары да колдонсо болот.
03-сүрөт: Western Blotting
Түндүк-Түштүк менен Батыш Блотингтин ортосунда кандай айырма бар?
Түндүк менен Түштүк жана Вестерн Блоттинг |
|
| Молекуланын түрү аныкталган | |
| Northern Blotting | Northern blotting РНК үлгүсүндөгү белгилүү бир РНК ырааттуулугун аныктайт. |
| Түштүк Блотинг | Түштүк блоттинг ДНК үлгүсүндөгү белгилүү бир ДНК ырааттуулугун аныктайт. |
| Western Blotting | Western blotting протеин үлгүсүнөн белгилүү бир протеинди аныктайт. |
| Гелдин түрү | |
| Northern Blotting | Бул агароза/формальдегид гелин колдонот. |
| Түштүк Блотинг | Бул Агароза гелин колдонот. |
| Western Blotting | Мында Полиакриламид гели колдонулат. |
| Блотинг ыкмасы | |
| Northern Blotting | Бул капиллярдык өткөрүү. |
| Түштүк Блотинг | Бул капиллярдык өткөрүү. |
| Western Blotting | Бул электрдик которуу. |
| Зонддор колдонулган | |
| Northern Blotting | cDNA же РНК зонддору радиоактивдүү же радиоактивдүү эмес деп белгиленген. |
| Түштүк Блотинг | ДНК зонддору радиоактивдүү же радиоактивдүү эмес деп белгиленет. |
| Western Blotting | Негизги антителолор зонд катары колдонулат. |
| Аныктоо системасы | |
| Northern Blotting | Бул авторадиография же жарыктын же түстүн өзгөрүшүн аныктоо аркылуу жасалат. |
| Түштүк Блотинг | Бул авторадиография, жарыкты же түстүн өзгөрүшүн аныктоо аркылуу жасалат. |
| Western Blotting | Бул жарыктын же түстүн өзгөрүшүн аныктоо аркылуу жасалат. |
Кыскача маалымат – Түндүк менен Түштүк жана Батыш Блтинг
Blotting - бул үлгүлөрдөн белгилүү ДНКны, РНКны же белокту аныктоо үчүн иштелип чыккан атайын ыкма. Белгилүү бир молекула түрүн аныктоо үчүн үч өзүнчө тазалоо процедурасы бар, атап айтканда, түндүк, түштүк жана батыш. Northern blotting ыкмасы РНКнын аралашмасынан белгилүү бир РНК ырааттуулугун аныктоо үчүн иштелип чыккан. Southern blotting ыкмасы ДНК үлгүсүндөгү белгилүү бир ДНК ырааттуулугун аныктоого мүмкүндүк берет жана western blotting ыкмасы белок аралашмасынан белгилүү бир белокту аныктоо үчүн иштелип чыккан.
